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银屑病项目立题研究

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  银屑病项目立题研究

  1.1研究内容

  (1) 运用免疫印迹和RT-PCR方法检测Jurkat T细胞,银屑病患者外周血T细胞及中性粒细胞中CD147表达水平,Jurkat 和外周血T 细胞中CyPA和CyPB表达水平。

  (2) 运用免疫组化法观察CD147,CyPA和CyPB在银屑病皮损中的表达和分布特点及其与病情的相关性。

  (3) 构建pSUPER/CD147siRNA质粒并转染银屑病患者外周血T细胞、中性粒细胞和Jurkat T细胞。

  (4) 运用免疫学常规实验方法观察CD147 siRNA转染对Jurkat 和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附作用的影响。

  (5) 运用中性粒细胞趋化性实验(Boyden chamber实验系统)观察CD147 siRNA转染对由CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化性的影响。

  1.2研究目标

  (1) 了解CD147分子及其配体CyPA和CyPB在Jurkat T细胞,银屑病外周血炎症细胞和皮损中的表达情况。

  (2) 通过CD147 siRNA技术明确CD147在Jurkat 和银屑病患者T细胞增殖、活化及基质黏附过程中的作用,及在CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化过程中的作用。

  (3) 建立银屑病实验动物模型,并通过该模型进一步明确CD147 siRNA能否在体内实验条件下缓解银屑病皮损发展的进程。

  (4) 结合本研究和我们前期研究结果,明确CD147分子在银屑病角质形成细胞异常增殖和分化、T细胞活化和基质黏附以及中性粒细胞趋化等重要发病环节中的作用和机制,为探寻银屑病新的研究领域和治疗方法提供理想的靶分子。

  1.3拟解决的关键问题

  (1) pSUPER/CD147siRNA质粒的构建及其细胞内的成功转染(干扰有效性

  (2) 银屑病实验动物模型(人银屑病皮损-SCID鼠移植模型)的建立

  (3) CD147分子在银屑病多个重要发病环节中的作用和机制,及其在银屑病治疗领域的开发运用前景。

  2、拟采取的研究方案及可行性分析。

  2.1 研究方法

  2.1.1 研究对象

  收集在温州东瓯皮肤科初次就诊,近三个月来未经任何系统和局部治疗的寻常型银屑病患者40例和脓疱型银屑病患者15例,同时收集20例健康人作对照。患者经皮肤活检进一步明确临床诊断,并对银屑病分型和疾病严重程度(PASI积分)进行临床评估。

  2.1.2 患者皮损中CD147,CyPA和CyPB表达和分布特点的检测

  皮肤活检取患者皮损和非皮损区皮肤及对照组皮肤制备石蜡包埋标本,连续切片,采用免疫组化法分别观察CD147,CyPA和CyPB在皮肤组织角质形成细胞,淋巴细胞和中性粒细胞等细胞成分中的表达和分布特点,并分析其与标本来源,银屑病分型和疾病严重程度间的关系。

  2.1.3 转染CD147siRNA对Jurkat 和患者T细胞增殖和活化的影响

  A. T细胞增殖状况的检测:实验分未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的Jurkat/患者T细胞(各1×106 个细胞)等六组,经PHA刺激后,于37℃下培养72小时,用常规MTT法检测细胞增殖情况。

  B. T细胞活化状况的检测:实验分组同上,经PHA刺激后,于37℃下培养72小时,采用经典的淋巴细胞转化实验,并检测IL-2和γ-干扰素来了解T细胞活化状况。

  2.1.4 转染CD147siRNA对Jurkat 和患者T细胞基质黏附作用的影响

  在无菌96孔板中加入纤维结合蛋白(1 μg/100 μl/每孔),经4℃过夜固化,包被并用0.5% BSA封闭非特异性结合位点。加入的细胞分未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的Jurkat/患者T细胞(各1×106 个细胞)等六组,经37℃ 孵育半小时后,倒去培养液,并用PBS洗去未黏附的T细胞。每孔加入25 mL MTT(终浓度5 moL/L)继续培养4 h,加入DMSO100 uL,震荡10 min,待紫蓝色颗粒完全溶解,在酶联免疫检测仪以490 nm 为检测波长,测各孔的A490值,并利用标准曲线量化黏附的T细胞数量(每组3个,重复三次,计数平均值)。

  2.1.5 转染CD147siRNA对由CyPA和CyPB介导的中性粒细胞趋化性的影响

  中性粒细胞趋化性实验仍采用我们曾成功用于检测皮肤肿瘤细胞迁移情况(国家自然科学基金,30200248)的博伊登室(Boyden chamber)实验系统,并作适当改动。博伊登室由上室和下室组成,上、下室由不含聚维酮的聚碳酸酯膜分隔,膜上有3-?m小孔,可通过趋化的中性粒细胞。

    上室中加入的细胞分为未转染、空白载体转染和CD147siRNA转染的中性粒细胞等三组,下室分为不加T细胞、加Jurkat/患者T细胞和加入经CyPA或CyPB抗体处理的Jurkat/患者T细胞七组。37℃ 孵育1小时后取下聚碳酸酯膜,采用膜染色细胞计数法检测膜底面的中性粒细胞数(每组3个,重复三次,计数平均值)。

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  2.1.6 人银屑病皮损-SCID鼠移植模型的建立

  十位寻常型银屑病患者的新鲜皮损(五位健康成人皮肤为对照)将作为供体使用,选择6-8周的SCID鼠为移植受体。每位供体取七块0.8×0.8cm大小皮片(银屑病皮损的临床表现相同)分别移植于七只SCID鼠背部,单线可吸收缝合,无菌纱布覆盖直至10天后愈合。

  2.1.7 移植皮片内细胞注射及组织学分析

  移植后第3周根据移植皮损的鳞屑多少、隆起和红斑情况对其进行临床积分评价(分为0-3分四级)。移植后第3周和第4周将用PBS稀释的细胞(200μl)注射到移植皮损的皮下(Jurkat 细胞组仅于第4周注射1次)。注射分七组:生理盐水组;Jurkat 细胞组;CD147siRNA转染Jurkat 细胞组;供体T细胞组;供体CD147siRNA转染T细胞组;供体中性粒细胞组和供体CD147siRNA转染中性粒细胞组。

  移植后第6周再次对皮损进行临床积分评价并作前后比较,处死SCID鼠,将移植皮损行石蜡包埋,切片。组织学分析包括:表皮厚度;角化不全发生情况;表皮中上层中性粒细胞聚集和Munro微脓疡形成情况;真皮浅层血管周围单一核炎症细胞浸润情况,并进行Ki-67(反映角质形成细胞增殖情况)、CD3(T细胞标记)和CD15(中性粒细胞标记)的免疫组化检测。

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